Retro viral vector

아래 표는 제공된 논문의 서론(Introductory Section)에서 소개된 주요 이슈, 연구 접근 방법, 그리고 연구의 필요성에 대해 정리한 것입니다. 주요 이슈 연구 접근 방법 연구의 필요성 레트로바이러스 벡터의 안전성 문제 - 5′ 비번역 리더 서열에서 모든 비정상적 AUG 코돈 및 바이러스 코딩 서열 제거<br>- 트랜스유전자를 gag 서열 대신 삽입 - 원치 않는 펩타이드의 발현 및 레트로바이러스 유전자와의 동종 재조합 위험 감소<br>- 유전자 치료에서의 안전성 향상 비정상적 AUG 코돈에 의한 번역 개시 문제 - 비정상적 AUG 코돈을 제거하여 번역 개시 가능성을 낮춤<br>- Kozak 서열과의 상동성 최적화 - 독성 또는 면역원성을 유발할 수 있는 원치 않는 단백질 번역 방지 레트로바이러스 재조합 위험성 - gag 및 pol 서열을 제거하고 대신 트랜스유전자를 삽입<br>- 최소 스플라이스 수용체(SAO) 도입 - 내재성 바이러스 또는 다른 바이러스 서열과의 재조합 가능성 감소<br>- 복제 가능성을 갖는 새로운 레트로바이러스 생성 위험 감소 리더 서열의 이중 기능 - 리더 서열에서 RNA 패키징 신호와 트랜스유전자 번역 효율을 동시에 최적화 - 벡터 생산 효율과 트랜스유전자 발현 효율을 동시에 높이기 위한 최적의 리더 서열 설계 필요 유전자 발현 효율성 저하 - 인공 인트론 도입으로 스플라이싱 효율 및 번역 효율 향상<br>- 스플라이스 도너 및 어셉터의 최적화 - 높은 수준의 트랜스유전자 발현을 통해 유전자 치료의 효율성 증대<br>- 다양한 트랜스유전자에 대한 일관된 발현 보장 클로닝 용량 제한 - 바이러스 코딩 서열 제거로 클로닝 용량 증가

CTE의 역할 및 중요성 CTE는 레트로바이러스의 스플라이싱되지 않은 mRNA를 핵 밖으로 수출하는 데 중요한 역할을 하는 cis-작용 요소입니다. 레트로바이러스에서는 완전히 스플라이싱되지 않은 전사체도 세포질로 수출되어야 하지만, 일반적인 mRNA 수출 메커니즘에서는 미스플라이싱된 mRNA의 수출이 금지되어 있습니다. CTE는 이러한 일반적인 제한을 극복할 수 있는 특이한 요소로, 숙주 세포의 특정 단백질과 결합하여 수출 과정을 촉진합니다. 2. 구체적인 방법 CTE는 mRNA의 특정 위치에 존재하며, 숙주 단백질과 결합하여 수출 복합체를 형성합니다. 이 복합체가 핵공(nuclear pore)을 통해 RNA를 세포질로 수출합니다. 대표적으로 *MPMV (Mason-Pfizer monkey virus)*와 같은 알파레트로바이러스에서 잘 연구된 바 있습니다. MPMV의 CTE는 Tap과 그 보조 단백질인 Nxt1와 같은 숙주 단백질과 결합하여 RNA 수출을 촉진합니다. 수출 과정은 크게 두 단계로 나눌 수 있습니다. CTE가 핵 내에서 Tap 단백질과 결합하여 RNA 수출을 위한 신호를 제공합니다. 이 결합 복합체는 핵공을 통과하여 RNA를 세포질로 운반합니다. 3. 예시 및 관련 숙주 단백질 MPMV에서 연구된 바에 따르면, CTE는 mRNA의 3' 말단 근처에 위치하며, 이 위치에서 Tap과 결합합니다. Tap은 숙주 세포의 주요 mRNA 수출 단백질로, Nxt1과 함께 작용하여 mRNA를 핵공을 통해 세포질로 수출합니다. 다른 예로, HIV-1에서는 CTE 대신 Rev 단백질과 *RRE (Rev Response Element)*가 유사한 기능을 합니다. Rev는 미스플라이싱된 RNA에 결합하여 RNA를 핵 밖으로 수출하도록 돕습니다. 이는 CRM1이라는 핵수출 인자와의 상호작용을 통해 이루어집니다. 4. CTE의 중요성 레트로바이러스의 경우, 스플라이싱되지 않은 전사체는 바이러스 입자를 형성하는 데 필수적인 단백질을 암호화하고 있습니다. 예를 들어, Gag와 Pol 단백질을 암호화하는 RNA는 스플라이싱되지 않은 상태로 세포질로 나가야 합니다. CTE와 같은 요소가 없다면, 바이러스는 이러한 중요한 전사체를 세포질로 수출할 수 없고, 이는 바이러스 복제와 감염성에 큰 영향을 미칩니다. CTE는 또한 다른 바이러스 유전자나 외부 유전자들이 정상적으로 발현될 수 있도록 돕기 때문에, 유전자 치료와 같은 바이러스 벡터 연구에서도 매우 중요한 요소로 활용됩니다. 5. 연구 및 응용 측면

1. RNA 포장 과정의 주요 요소 바이러스 RNA 게놈은 게놈의 5' 말단 근처에 있는 Psi (포장) 서열과 Gag 단백질의 NC 도메인 사이의 상호작용으로 바이러스 입자에 포장됩니다. 이 상호작용은 in vitro에서도 쉽게 관찰되지만, 그 특이성을 입증하는 것은 어렵습니다. 2. Gag 단백질의 역할 바이러스 RNA를 포장하는 단백질 형태는 Gag 전구체이며, 특히 NC 부분이 가장 큰 역할을 합니다. NC 단백질의 Cys-His 상자(짧은 서열 블록으로, 징크 핑거 모양의 구조를 가짐)가 포장에 중요한 역할을 하며, 이 외에도 NC 분자 내의 기본 잔기도 중요합니다. NC와 결합하는 서열이 노출되거나 숨겨지도록 RNA 구조가 변화할 수 있으며, RNA가 포장될지 번역될지에 따라 이 결합 부위의 가시성이 달라집니다. 3. 포장에 중요한 RNA 서열 바이러스 RNA 게놈의 포장 또는 Psi 서열은 각 바이러스마다 다르며, 일반적으로 LTR과 Gag 사이의 5' 말단 근처에 위치합니다. 이러한 서열은 자가적으로 기능할 수 있는 능력을 가지며, 다른 위치로 이동되어도 어느 정도 기능을 유지할 수 있습니다. 특정 스템 루프 구조가 포장 효율에 기여하며, 일부 경우에는 완전히 다른 서열로 대체되어도 NC와의 결합 기능만 유지되면 잘 포장될 수 있습니다. 4. 바이러스 게놈의 이량체화 성숙한 바이러스 입자는 70S 이량체로 불리는 안정된 RNA 구조를 포함하고 있으며, 이는 매우 압축된 형태입니다. RNA의 5' 말단에 있는 *DIS (이량체화 개시 서열)*는 RNA 이량체화를 위한 필수 요소이며, NC가 이 과정에서 중요한 역할을 합니다. 이량체화가 포장의 선행 조건일 수 있으며, 일부 돌연변이는 RNA의 단량체와 이량체의 균형을 변화시켜 포장 효율에 영향을 줄 수 있습니다. 5. tRNA 프라이머의 포장 RNA 포장의 중요한 부분 중 하나는 숙주의 tRNA를 바이러스 RNA와 함께 포장하여 마이너스 가닥 DNA 합성을 위한 초기 프라이머로 사용하는 것입니다.

<Image from Fields Virology> 레트로바이러스의 모든 복제 가능한 게놈은 최소한 gag, pro, pol, env라는 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함합니다. 이 유전자들은 복잡한 메커니즘에 의해 전사되며 전구 단백질(pre-cursor protein)로 만들어진 뒤, 바이러스 입자 조립 중과 이후에 처리되어 최종적으로 감염성을 가진 성숙한 바이러스 입자로 형성됩니다. 전구 단백질로 먼저 합성된 후 처리되는 방식은 다음과 같은 여러 가지 이점을 제공합니다: Gag 유전자 발현 하나의 ORF로부터 여러 단백질을 생성할 수 있음 단백질들이 올바른 비율로 생성됨을 보장 많은 단백질이 하나의 단위로 바이러스 입자에 효율적으로 전달됨 1. Gag 유전자 발현 gag 유전자는 모든 레트로바이러스 게놈의 5' 말단에 위치하며, 바이러스 RNA와 동일한 긴 mRNA가 번역되어 50-80 kDa 크기의 Gag 전구 단백질을 형성합니다. 번역은 AUG 시작 코돈에서 시작되어 ORF의 3' 말단에 있는 종결 코돈까지 진행됩니다. 5' 비번역 영역(UTR)이 길어서 리보솜이 Gag를 번역하기 위해 스캔하는 것이 어려울 수 있습니다. 일부 바이러스에서는 IRES(내부 리보솜 결합 부위) 요소를 사용하여 캡 의존적인 방식이 아닌 번역을 시작합니다. 2. glycoGag 단백질 일부 감마레트로바이러스는 주요 Gag 단백질 외에 추가적인 glycoGag 단백질을 암호화합니다. 이 단백질은 일반적인 AUG보다 상류에 위치한 비전형적인 CUG 코돈에서 드물게 번역이 시작됩니다. glycoGag는 세포막에 결합된 당단백질 형태로 세포 표면에 위치하며 바이러스 입자 방출을 돕고, HIV-1의 Nef 단백질 기능을 모방하여 바이러스 방출을 촉진합니다. 3. Gag 단백질의 변형 주요 Gag 단백질은 myristic acid라는 14탄소 지방산이 Gag 단백질의 아미노말단에 결합되며, 이를 통해 막에 결합하는 특성을 갖게 됩니다. 이 과정은 코번역적으로 이루어지며, 지방산은 Gag 전구체의 막 표적화와 결합에 중요한 역할을 합니다.

RNA 전사의 시작 Provirus에는 두 개의 동일한 *long terminal repeats (LTRs)*가 포함되어 있어, 전사가 5' LTR 또는 3' LTR에서 시작될 수 있습니다. 그러나 일반적으로 5' LTR에서 전사가 더 효율적으로 이루어집니다. 상류 프로모터에서 시작된 전사가 하류 프로모터의 사용을 억제하는 *프로모터 간섭(promoter interference)*이 발생할 수 있습니다. 일반적으로 5' LTR에서 시작된 전사체가 우세합니다. HTLV-1의 특이성 특정 레트로바이러스, 예를 들어 HTLV-1,는 3' LTR에서 시작해 5' LTR로 연장되는 반대 방향 전사체를 형성합니다. 이 전사체는 HBZ라는 단백질을 암호화하며, 이 단백질은 바이러스의 암유발 활동에 중요한 역할을 하고 Tax 단백질을 억제합니다. RNA 처리 (Processing) 풀 길이의 폴리아데닐화된 전사체는 여러 경로로 나뉩니다. 일부 전사체는 세포핵 밖으로 나가 바이러스 입자에 포장되어 사용됩니다. 또 다른 일부는 Gag 및 Gag-Pol 폴리프로틴을 형성하기 위해 번역에 사용됩니다. 나머지 전사체는 스플라이싱되어 하위 유전자 RNA를 형성합니다. 단순 레트로바이러스는 주로 Env 단백질을 암호화하는 단일 스플라이싱된 mRNA를 가지며, 복잡한 레트로바이러스는 다양한 보조 단백질을 암호화하는 여러 스플라이싱된 mRNA를 형성할 수 있습니다. 미스플라이싱된 RNA의 수출 촉진 보통 mRNA는 스플라이싱이 완료된 후에만 핵 밖으로 수출됩니다. 그러나 레트로바이러스는 스플라이싱이 완전히 완료되지 않은 상태에서 일부 전사체를 핵 밖으로 수출하는 특이한 방식을 사용합니다. 이 과정에는 몇 가지 요소가 관여하는데, 예를 들어 바이러스 RNA의 스플라이싱 부위가 스플라이싱 기계에 의해 비효율적으로 사용될 수 있도록 설계되어 있습니다. 스플라이싱 효율이 너무 높아지면 바이러스 복제에 불리하기 때문에 이와 관련된 돌연변이가 발생하면, 보조 돌연변이를 통해 스플라이싱 효율이 다시 줄어들기도 합니다.

바이러스의 RNA 합성 과정은 다음과 같이 요약할 수 있습니다. RNA 전사 과정 바이러스 DNA로부터 바이러스 RNA가 만들어지면, 먼저 긴 1차 전사체가 형성되고 이후 여러 가지로 가공되고 스플라이싱되어 안정된 소수의 전사체를 생성하게 됩니다. LTR의 U3 영역에는 RNA 중합효소 II 시스템이 인식하는 프로모터가 있으며, 이 프로모터가 U3-R 경계에서 전사를 시작하도록 지시합니다. 전사가 진행되면 게놈을 지나 3' LTR까지 계속 진행되고, 최종적으로 RNA는 3' LTR의 R-U5 경계에서 절단 및 폴리A화 되어 완전한 미스플라이싱된 바이러스 RNA가 만들어집니다. 이 RNA는 비리온 입자에 포장되어 나중에 사용될 준비가 됩니다. 전사 개시 5' LTR의 U3-R 경계에서의 전사 개시 효율은 세포 내에서 만들어지는 바이러스 RNA 양의 주요 결정 요소입니다. LTR 내의 프로모터는 일반적으로 강력하며, 바이러스 RNA의 수준이 항상 높을 수 있습니다. 그러나 세포 유형, 생리적 상태, 통합 위치 등에 따라 전사 효율은 크게 달라질 수 있습니다. 양성 조절 요소 (Positive Regulatory Elements) in U3 U3 영역에는 기본 프로모터 서열과 증강자(enhancer)가 포함되어 있습니다. 프로모터 서열에는 TATA 박스와 CCAAT 박스가 있으며, 이들 서열은 여러 숙주 전사 인자에 의해 조절됩니다. 서로 다른 세포들은 각각의 인자를 이용하여 바이러스 전사를 다르게 조절합니다. 음성 조절 요소 (Negative Regulatory Elements) 바이러스 발현을 억제하는 음성 조절 인자도 존재합니다. 예를 들어, 배아 암세포와 진정한 배아세포는 LTR에 의한 전사를 강하게 억제하는 음성 조절 단백질을 발현하여 바이러스 발현을 억제합니다. **trans-작용 바이러스 조절 인자 (Trans-Acting Viral Regulatory Factors) 복잡한 레트로바이러스들은 바이러스 LTR에서 전사를 활성화할 수 있는 작은 조절 단백질을 암호화합니다. 예를 들어, HTLV-1의 Tax 단백질과 HIV-1의 Tat 단백질이 있습니다.

<Image from Fields Virology> 역전사는 바이러스 RNA 게놈을 이중가닥 DNA 형태로 바꾸는 과정으로, 레트로바이러스의 가장 특징적인 단계입니다. 이 과정은 여러 복잡한 단계로 이루어져 있으며, 각각의 DNA 합성 시작 위치가 정밀하게 지정되어 있습니다. 아래는 주요 단계를 쉽게 설명한 것입니다. 역전사의 시작 바이러스가 세포 내부로 들어가면, 바이러스 핵심 구조 내에서 역전사가 시작됩니다. 이 과정은 대개 바이러스 RNA와 결합된 tRNA에서 시작되며, 이 tRNA는 RNA와 상보적인 서열을 가집니다. 이 tRNA의 3' 말단에서 DNA 합성이 시작되어 "마이너스 가닥 강한 정지 DNA(minus strand strong stop DNA)"가 만들어집니다. 첫 번째 이동 (Translocation) 합성된 마이너스 가닥 강한 정지 DNA는 게놈의 3' 말단으로 이동합니다. 이 과정에서 RNA는 RNase H라는 효소에 의해 분해되며, 이 효소는 RNA와 DNA가 혼합된 형태만을 분해할 수 있습니다. 이렇게 노출된 단일가닥 DNA는 게놈의 3' 말단 서열과 결합합니다. 긴 마이너스 가닥 합성 마이너스 가닥이 결합된 후, 역전사 효소는 계속해서 마이너스 가닥을 연장하여 길게 합성합니다. 합성 과정에서 RNA는 RNase H에 의해 분해됩니다. 플러스 가닥 DNA 합성 시작 플러스 가닥 합성의 시작점은 RNA의 3' 말단 근처의 폴리퓨린 트랙(ppt)이라는 서열로, 이 서열은 RNase H에 의해 잘리지 않아서 플러스 가닥 합성의 프라이머로 사용됩니다. 플러스 가닥은 마이너스 가닥을 템플릿으로 하여 합성됩니다. 프라이머 tRNA 제거 플러스 가닥 합성이 완료되면, 마이너스 가닥에 붙어 있던 tRNA 프라이머가 RNase H에 의해 제거됩니다. 이 과정에서 DNA의 5' 말단에 남아 있는 단일 염기가 후속 과정에 영향을 주지 않으므로 그대로 남습니다. 두 번째 이동 (Second Translocation) 플러스 가닥 강한 정지 DNA의 3' 말단이 마이너스 가닥의 3' 말단과 결합하여 원형의 중간체가 형성됩니다.

<Image from Fields Virology> 바이러스 게놈의 변화 게놈 형태의 변화 바이러스의 생활사(life cycle)는 RNA 게놈으로 시작해서, 세포 내부에서 DNA 형태로 바뀌었다가, 다시 RNA 형태로 돌아오는 과정으로 구성됩니다. 역전사 과정에서의 변화 바이러스 입자에 있는 RNA 게놈에는 짧은 말단 반복 서열(R 서열)이 포함되어 있습니다. 역전사 과정 중, U5와 U3라는 서열 블록이 복제되어 결과적으로 만들어진 이중가닥 DNA는 원래의 RNA보다 양쪽 끝이 더 길어집니다. 이렇게 만들어진 DNA는 양 끝에 *long terminal repeats (LTRs)*를 가지게 되며, LTR은 U3, R, U5 서열로 구성됩니다. DNA 통합 과정 이 DNA는 숙주 세포의 DNA에 통합되어 provirus가 됩니다. 통합된 provirus는 통합 전의 DNA와 같은 형태이며, LTR도 그대로 유지됩니다 (통합 과정에서 한두 개의 염기가 손실될 수 있음). RNA 재생성 이후, DNA는 RNA 중합효소 II 시스템에 의해 전사되어 자손 RNA 게놈을 생성. 이 전사는 5' LTR의 U3-R 경계에서 시작되어 게놈을 따라 진행되며, 전사된 RNA는 3' LTR의 R-U5 경계에서 가공 및 polyadenylation을 통해 마무리됩니다. 이렇게 생성된 RNA는 원래 입력 RNA와 동일한 구조를 가지며, 짧은 말단 반복 서열(R 서열)도 포함 이 RNA는 바이러스 입자에 포장되고 외부로 배출. 즉, 바이러스의 게놈은 생활사 중에 RNA -> DNA -> RNA로 여러 번 형태가 바뀌며, 각각의 과정에서 특유의 서열이 추가되거나 복제되면서 유전 정보가 전달

핵심 정리: RNA 게놈의 구성 <Image from Fields Virology> RNA 게놈 구조 바이러스의 게놈은 선형의 양성 단일가닥 RNA로 이루어진 동형 이량체(homodimer)이며, 각각의 RNA 단편은 7~13 kb 길이. 이량체 형성은 두 RNA의 5' 말단의 자가 상보적인 영역인 *dimer initiation site (DIS)*에서 시작. RNA의 특징 게놈 RNA는 mRNA의 여러 특징을 가짐: 5' 캡(m7G5′ppp5′Gmp 구조)과 3' 말단에 약 200 nt 길이의 poly(A) 서열. 주요한 후전사적 변형을 포함: 2′O-메틸화와 아데노신 N-6-메틸화. 비암호화(non-coding) 서열 게놈의 양 끝에 위치한 여러 중요한 비암호화 서열이 있으며, 이들은 바이러스 생활사에서 중요한 역할을 함. R (Repeated region): 5' 및 3' 말단에 모두 존재하는 반복된 서열. U5 (Unique 5' sequence): 5' R의 하류에 위치하며, 통합을 위한 att 부위 포함. Primer Binding Site (pbs): 호스트 tRNA가 결합하여 마이너스 가닥 DNA 합성이 시작되는 18-nt 서열. 캡시드 포장 신호 및 스플라이싱 부위 pbs의 하류에는 바이러스 RNA를 비리온 입자에 포장하기 위한 Psi element 존재. 주요 스플라이스 제공자 부위도 포함되어 있어, 부분적 mRNA 형성에 기여. 세 개의 주요 유전자 gag: 내부 구조 단백질을 암호화. pol: 폴리메라제 암호화. env: 외피 단백질 암호화. 단순한 레트로바이러스의 경우 이 세 유전자가 게놈의 거의 대부분을 차지.