공부

유전자를 타겟으로 하는 shRNA 서열을 선정하고 실험을 준비하기 위한 구체적인 workflow를 제시하겠습니다. 목표는 각 유전자에 대해 효과적인 shRNA 서열 3개를 선정하는 것입니다. Step 1: shRNA 서열 디자인 유전자 서열 검색 (1일) NCBI, Ensembl, UCSC Genome Browser 같은 유전체 데이터베이스에서 유전자1과 유전자2 유전자 서열을 검색합니다. 각 유전자의 mRNA 서열(특히 open reading frame, ORF)을 다운로드합니다. shRNA 서열 디자인 도구 사용 (1–2일) Dharmacon, Sigma-Aldrich, RNAi Designer, siDirect 같은 온라인 shRNA 디자인 툴을 이용해 유전자1과 유전자2 를 타겟으로 하는 shRNA 서열을 자동으로 생성합니다. 이 도구들은 유전자의 서열에서 효과적인 19–21nt의 타겟 서열을 예측하며, off-target 가능성을 최소화하는 최적의 서열을 제공합니다. 각 유전자에 대해 3개의 shRNA 서열을 선택합니다. Off-target 분석 (1일) 선택된 shRNA 서열에 대해 BLAST를 사용하여 유사한 다른 유전자 서열과의 비특이적 결합 가능성을 확인합니다. Off-target 영향을 줄이기 위해 가능한 한 타겟 서열의 고유성을 확인합니다. 구조적 분석 (1일) RNA secondary structure prediction tools(예: RNAfold)를 사용하여 shRNA 서열이 mRNA의 구조적 안정성을 방해할 가능성이 있는지 분석합니다. 불안정한 구조나 효율이 떨어질 수 있는 서열은 제외하고, 최종적으로 각 유전자에 대해 3개의 shRNA 서열을 선정합니다. Step 2: shRNA 벡터 설계 shRNA 벡터 정보 수집 (1일) 사용할 shRNA 벡터를 결정합니다. 예를 들어, pLKO.1, GIPZ 등의 상업용 벡터 또는 맞춤형 벡터를 사용할 수 있습니다. 벡터 내에 puromycin이나 GFP 등의 선택 마커가 있는지 확인하고, 실험에서 사용할 항생제와 보고 유전자를 고려하여 벡터를 선택합니다. shRNA 서열을 벡터에 맞게 최적화 (1일) shRNA 서열의 sense와 antisense를 적절히 배치하고, 루프 서열을 추가하여 벡터에 클로닝할 수 있도록 서열을 최종 확인합니다.