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Experimental methods

Western blot

Category
  1. circRNAs
  2. Experimental methods
메모
protein expression level
Created by
  • J
    Jina Amie
Created at
▪︎ DW (3차 증류 autoclave 돌린 것), Tris-Cl, SDS: 상온 shelf
▪︎ Acrylamide, sucrose, APS: 4℃ 냉장고
▪︎ Isopropanol: yellow cabinet
▪︎ TEMED: 전기영동 box
▪︎ conical tube 세척된 곳에서 running gel, stacking gel 용 가져오기
[Western blot gel 만들기]
▪︎ western blot 조립
1) 3개의 나사 중 양쪽 중간 나사를 조이고
2) 아래쪽 아구가 맞는지 확인한다
3) 나머지 나사 조이고
4) 자투리 3M paper로 바세린 발라서
5) 조립 후 증류수 부어서 새는지 확인
▪︎ Resolving gel & Stacking gel Mixture
1) TEMED 빼고 tube에 담아서 voltexing
⇒ TEMED는 APS 반응 촉매제로 혼합물을 gel 형태로 굳히는 역할을 한다.
TEMED는 적혀있는 정량보다 많이, 10µl 정도 넣음 (빨리 굳히기 위함)
⇒ APS 넣기 전 APS voltexing 하고 mix 만들기
2) stacking mix는 ice에 두고, resolving gel부터! 계기판에 부었던 증류수 버리고 3M paper로 물기 제거.
3) Mix (TEMED 첨가) 총 10ml 중 7ml를 넣어서 굳힌다.
⇒ 이때 위에 isopropanol을 뿌려준다.
⇒ 남은 3ml의 resolving gel이 굳는 것(뚜껑 열어두기!)을 통해 gel의 굳기 정도를 확인할 수 있다.
4) 굳으면, isopropanol을 증류수로 washing 하고 3M paper로 물기 제거.
5) TEMED 첨가한 stacking gel을 1ml씩 따서 층층이 넣어준다.
6) well mold를 닦고 껴준다. (* bubble 생기지 않도록 조심)
⇒ 넘치는 부분의 mix를 따서 골고루 잘 높이를 맞춰주고, 굳힌다.
[Gel running & Transfer]
▪︎ Sample 만들기
well 10칸 기준으로 [sample + marker]의 수가 더 적으면, 양쪽 끝에 buffer만 따로 만들어서 running한다.
1) protein quantitation을 통해 원하는 sample 내 protein 양을 설정 (보통 30-50µl 정도)
2) BF는 단백질 lysis BF를 사용하면 됨
3) Sample 모두 만든 후 100℃에서 5분 끓이기 (꼭 bath 미리 데워두기!)
4) RT 보관, Stacking gel 굳은 것 확인 후 loading 준비
▪︎ Gel electrophoresis [130V, 60min + 10min]
1) well mold를 빼기 전 네임펜으로 well 위치를 표시해 준다.
2) SDS-PAGE 조립 후
3) 안쪽에는 new one, 바깥쪽에는 used one의 SDS PAGE 용액 BF을 부어준다.
▪︎ Transfer [20V, 90min]
(- 위) 3M 4장 + gel + PVDF + 3M 4장 (+ 아래) (* 위아래 확인 잘하기..... )
1) PVDF는 사용 전에 activation 필요 ⇒ methanol 준비 (최소 1min 이상, 전기영동 끝난 후~ transfer 전, yellow cabinet)
2) 3M paper 8장 ⇒ transfer BF에 적시기
3) 위 순서대로 gel을 알맞게 잘라서 쌓고 transfer machine 연결
▪︎ Blocking [30min]
1) labeling
2) TBST 5% milk에 30min 이상
3) 이후 원하는 1차 항체를 붙여 O/N 진행 (4℃ ref)
▪︎ 1st Ab, 2nd Ab binding
1) O/N으로 1st Ab 붙인 것 washing
: 남은 Ab 용액은 다시 냉장고 tube에 담고,
: TBS-T 용액으로 15min, 5min, 5min 3번에 걸쳐서 washing
2) 2nd Ab 1H
: 계수대의 Tube가져다가 2nd Ab 1:3000 으로 만들기 (1% milk 사용)
3) 2nd Ab 붙인 것 washing
: TBS-T 용액으로 15min, 5min, 5min 3번에 걸쳐서 washing
4) Chemidot 촬영
: substrate 1:1로 섞어서 Mix 준비 (well 10개 전체 transfer한 paper 1개 기준 Mix 1ml)
: 뒤집어서 반응 후 1-2min
: saturated 꼭 확인 ⇒ tif로 usb에 담아 오기
5) Antibody stripping
: 10min, 10min, 10min
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